L'ISPETTORE GENERALE REPRESSIONI FRODI
Visti gli articoli 8 e 9 della legge 19 ottobre 1984, n. 748,
concernente: "Nuove norme per la disciplina dei fertilizzanti", i
quali prescrivono che i concimi e gli ammendanti e correttivi vengano
controllati con i metodi di campionamento e di analisi adottati con
decreto del Ministro dell'agricoltura e delle foreste, sentito il
parere della Commissione di cui agli articoli 110, 111, 112 del
decreto del Presidente della Repubblica 12 febbraio 1965, n. 162;
Visto altresi' l'art. 115 del citato decreto del Presidente della
Repubblica 12 febbraio 1965, n. 162;
Vista la legge 7 agosto 1986, n. 462, con la quale e' stato, tra
l'altro, istituito l'Ispettorato centrale per la repressione frodi
per l'esercizio delle funzioni inerenti alla prevenzione e alla
repressione delle infrazioni nella preparazione e commercio dei
prodotti agro-alimentari e delle sostanze di uso agrario e forestale;
Visto l'art. 3 della legge 9 marzo 2001, n. 49, riguardante
"Ulteriori interventi per fronteggiare l'emergenza derivante
dall'encefalopatia spongiforme bovina", secondo il quale, nell'ambito
delle disposizioni in materia di controlli e di personale,
l'Ispettorato centrale repressione frodi, posto alle dirette
dipendenze del Ministro delle politiche agricole e forestali, opera
con organico proprio ed autonomia organizzativa ed amministrativa e
costituisce un autonomo centro di responsabilita' di spesa;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 18 gennaio 1988
che, tra le funzioni attribuite alle Divisioni dell'Ispettorato
centrale repressione frodi, prevede l'elaborazione e l'aggiornamento
dei metodi ufficiali di analisi per i prodotti agro-alimentari e le
sostanze di uso agrario e forestale;
Visti i decreti ministeriali 24 marzo 1986, 19 luglio 1989,
23 gennaio 1991, 10 marzo 1993, 28 settembre 1993, 5 dicembre 1995 e
21 dicembre 2000, relativi all'approvazione dei "Metodi ufficiali di
analisi per i fertilizzanti", pubblicati rispettivamente nei
supplementi ordinari alla Gazzetta Ufficiale della Repubblica
italiana n. 180 del 5 agosto 1986, n. 196 del 23 agosto 1989, n. 29
del 4 febbraio 1991, nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica
italiana n. 73 del 29 marzo 1993, nella Gazzetta Ufficiale della
Repubblica italiana n. 238 del 9 ottobre 1993, nella Gazzetta
Ufficiale della Repubblica italiana n. 18 del 23 gennaio 1996 e nella
Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana n. 21 del 26 gennaio
2001;
Sentito il parere della sopracitata Commissione per l'aggiornamento
dei metodi ufficiali di analisi, sottocommissione fertilizzanti,
rinnovata col decreto ministeriale 20 settembre 2000, pubblicato
nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana n. 236 del 9
ottobre 2000, modificata da ultimo, per quanto attiene la
sottocommissione fertilizzanti, col decreto ministeriale 28 settembre
2000, pubblicato nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana
n. 249 del 24 ottobre 2000;
Visto il decreto legislativo 30 marzo 2001, n. 165, concernente
norme generali sull'ordinamento del lavoro alle dipendenze delle
amministrazioni pubbliche;
Ritenuto necessario aggiornare i metodi di analisi approvati con i
succitati decreti ministeriali;
Vista la direttiva 98/34/CE, concernente le procedure
d'informazione nel settore delle norme e regolamentazioni tecniche, e
successive modificazioni, attuata con decreto legislativo 23 novembre
2000, n. 427;
Decreta:
Art. 1.
1. Sono approvati i "Metodi ufficiali di analisi per i
fertilizzanti - supplemento n. 7" descritti nell'allegato al presente
decreto.
2. I metodi di analisi riportati in allegato al presente decreto si
applicano ai concimi nazionali.
Art. 2.
Il presente decreto sara' inviato al competente organo di controllo
per la registrazione ed entra in vigore il giorno successivo alla sua
pubblicazione nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana.
Roma, 17 giugno 2002
L'Ispettore generale capo: Lo Piparo
Allegato
(di cui all'art. 1)
ESTRAZIONE DEI FOSFATI SOLUBILI IN ACQUA
E CITRATO AMMONICO NEUTRO
1. Oggetto
Il presente documento fissa le modalita' esecutive e le
condizioni per la estrazione in sequenza dei fosfati solubili in
acqua e in citrato ammonico neutro operando sulla stessa pesata del
campione in esame.
2. Campo di applicazione
Il metodo si applica a tutti i concimi organo-minerali per i
quali in etichetta venga dichiarata l'anidride fosforica solubile in
acqua e citrato ammonico neutro, nonche' le singole solubilita',
qualora vengano dichiarate.
3. Principio
I fosfati solubili in acqua vengono estratti mediante
percolazioni successive. I fosfati solubili in citrato ammonico
neutro vengono estratti a caldo dal residuo dell'estrazione con
acqua, mediante la soluzione citrico ammoniacale.
4. Reattivi
Nel corso dell'analisi impiegare acqua distillata o
demineralizzata di purezza equivalente e reattivi di qualita'
analitica riconosciuta.
4.1. Soluzione neutra di citrato ammonico preparata come
descritto al punto 4.1. del Metodo 3.1.4. riportato nella Parte I
della raccolta dei metodi ufficiali di analisi (metodi di analisi
comunitari).
4.2. Acido nitrico diluito 1 + 1.
5. Apparecchiatura
5.1. Imbuti di vetro Ø 7,5 cm con insenature interne per
filtrazioni rapide, angolo 60.
5.2. pHmetro.
5.3. Matracci tarati da 500 ml.
5.4. Bagno termostatico capace di mantenere la temperatura di 65
oC, munito di un adatto agitatore (vedere ad es. fig. 8 citata nel
metodo 3.1.4).
5.5. Filtri rapidi tipo Supervelox o equivalenti. In caso di
particellato molto fine ricorrere a filtri tipo Schleicher & Schüll
5892 Ø cm 9 o equivalenti.
6. Procedimento
Pesare 1 g (con l'approssimazione di 0,001 g) di campione
preparato secondo quanto previsto dal Metodo 1 riportato nella Parte
I della raccolta dei metodi ufficiali d'analisi.
6.1. Estrazione dei fosfati solubili in acqua.
Trasferire il campione sul filtro tarato da 9 cm di diametro
(5.5.), convenientemente preparato sull'imbuto (5.1.), e lavare per
gravita' con acqua mediante piccole aliquote successive fino a circa
400 ml di filtrato; raccogliere il filtrato in un matraccio da 500 mL
(5.3.) contenente 5 mL di HNO in base 3 (4.2.).
Lasciare che ciascuna frazione di liquido passi completamente
attraverso il filtro prima di effettuare la nuova aggiunta. Terminato
l'ultimo lavaggio, rimuovere il filtro contenente il residuo
insolubile in acqua; lavare l'imbuto con acqua, portare a volume e
agitare. L'operazione descritta deve avvenire entro 1 ora.
6.2. Estrazione dei fosfati solubili in citrato.
6.2.1. Preparazione dell'estratto citro-ammoniacale.
Dopo il trattamento con acqua, entro 1 ora trasferire il filtro e
il residuo, ottenuti a seguito dell'estrazione 6.1. in una beuta da
mL 200 o 250 contenente mL 100 della soluzione di citrato ammonico
(4.1.) previamente scaldata a 65 oC. Chiudere ermeticamente la beuta
con un tappo di gomma tenera, agitare vigorosamente, poi togliere per
un momento il tappo per equilibrare la pressione. Immergere la beuta
nel bagnomaria (5.4.) e fissarla all'agitatore. Durante l'agitazione
il livello della sospensione nella beuta dovra' costantemente essere
al di sotto del livello dell'acqua del bagnomaria. L'agitazione
meccanica sara' tale da mantenere sempre in sospensione il materiale
(N.B.: in mancanza di un agitatore meccanico, si puo' agitare a mano
ogni 5 minuti).
Esattamente 1 ora dopo l'aggiunta del filtro e del residuo,
togliere la beuta dal bagnomaria e filtrare immediatamente su un
filtro tarato da 9 cm di diametro (5.5.) convenientemente preparato
su imbuto in vetro (5.1.), in un matraccio tarato da 500 mL (5.3.).
Al fine di un recupero quantitativo, lavare il filtro ed il residuo
rimasti ancora nella beuta di estrazione con piccole aliquote di
acqua a 65 oC, fino a 400 ml di filtrato, trasferendo ogni volta sul
filtro di raccolta, assicurandosi che il filtro rimasto nella beuta
sia completamente schiarito al termine dei lavaggi da tutte le
sostanze coloranti eventualmente provenienti dal concime
organo-minerale. Al termine dell'ultimo lavaggio, lasciare
raffreddare e poi portare a volume con acqua e agitare. Un eventuale
intorbidamento che dovesse verificarsi durante o dopo i lavaggi con
acqua, dovuto a fenomeni di idrolisi, non ha importanza ai fini
dell'esattezza dell'analisi e vi si potra' ovviare aggiungendo al
filtrato, prima di portare a volume, 1-2 mL di acido nitrico diluito
(4.2.).
6.3. Dosaggio.
Prelevare con pipetta di precisione uguali aliquote di estratto
acquoso (6.1.) e di estratto in citrato (6.2.) in modo che, in
totale, la quantita' di P in base 2 O in base 5 presente sia circa
pari a 0,010 g e poi procedere alla determinazione dei fosfati
secondo il Metodo n. 3.2 riportato nella Parte I della raccolta dei
metodi ufficiali di analisi.
6.4. In tabella 1 vengono riportate le aliquote da prelevare in
funzione dei titoli dichiarati in P in base 2 O in base 5 solubile in
acqua e citrato ammonico neutro dei concimi organominerali.
Tabella 1
====================================================================
| | Diluizione in mL | Prelievi degli |
| | | estratti in mL |
% P in base 2 | Pesata |-------------------|-----------------|Totale
O in base 5 | in g | | | | in | mL
dichiarato | | acqua | citrato |acquoso |citrato |
| | | | | neutro |
--------------|--------|---------|---------|--------|--------|------
5-10.... | 1 | 500 | 500 | 50 | 50 | 100
10-25.... | 1 | 500 | 500 | 25 | 25 | 50
> 25.... | 1 | 500 | 500 | 10 | 10 | 20
DETERMINAZIONE DI CADMIO, CROMO, RAME,
NICHEL E ZINCO TOTALI
1. Oggetto
Il presente documento fissa un metodo per la determinazione di
cadmio, cromo, rame, nichel e zinco estraibili mediante trattamento
con acqua regia.
2. Campo di applicazione
Il metodo e' applicabile ai concimi nazionali, agli ammendanti ed
ai correttivi.
3. Principio
La solubilizzazione dei metalli viene effettuata con soluzione
nitrico-cloridrica a caldo.
La determinazione dei metalli estratti viene effettuata mediante
spettrometria di assorbimento atomico con atomizzazione in fiamma.
Gli elementi normalmente presenti nei fertilizzanti non creano
significative interferenze in questa determinazione.
4. Reattivi
Nel corso dell'analisi impiegare acqua distillata o
demineralizzata di purezza equivalente e reattivi di qualita'
analitica riconosciuta.
4.1. Acido cloridrico concentrato HC1 al 37% (rho = 1,186)
4.2. Acido cloridrico, soluzione 1:1
Diluire 500 mL di acido cloridrico (4.1) con 500 mL di acqua.
4.3. Acido cloridrico, soluzione 10 mL/L.
Diluire 10 mL di acido cloridrico (4.1.) in un matraccio tarato
da 1000 mL con acqua fino a volume.
4.4. Acido nitrico concentrato, HNO in base 3, al 65%
(rho = 1,40)
4.5. Acido nitrico, soluzione 1:1
Diluire 500 mL di acido nitrico (4.4.) con 500 mL di acqua.
4.6. Acido nitrico, soluzione 10 mL/L:
Diluire 10 mL di acido nitrico (4.4.) in un matraccio tarato da
1000 mL con acqua fino a volume.
4.7. Soluzione di lantanio (10 g/L).
Utilizzare tale reattivo per il dosaggio dello zinco. Porre, in
un matraccio tarato da 1 L, 11,73 g di lantanio ossido (La in base 2
O in base 3), unitamente a 150 mL di acqua. Aggiungere quindi con
cautela 100 mL di acido cloridrico al 37 % (4.1.), mescolare e
portare a volume di 1 L con acqua.
4.8. Cadmio, soluzione di riferimento a 1000 mg/L di Cd.
Pesare 1,000 g di cadmio metallico purissimo in un bicchiere da
250 mL. Addizionare lentamente 50 mL di acido cloridrico 1:1 (4.2.),
far reagire a temperatura ambiente per 30 min. e quindi completare la
dissoluzione ponendo il bicchiere su piastra calda. Travasare
quantitativamente in un matraccio tarato da 1000 mL e portare a
volume con acido cloridrico 10 mL/L (4.3.). Tappare ed omogeneizzare.
4.9. Cromo, soluzione di riferimento a 1000 mg/L di Cr.
Pesare 3,735 g di potassio cromato, (K in base 2 CrO in base 4),
previamente essiccato a 130 oC per due ore, in un matraccio tarato da
1000 mL, solubilizzare e portare a volume con acqua. Tappare ed
omogeneizzare.
4.10. Rame, soluzione di riferimento a 1000 mg/L di Cu.
Pesare 1,000 g di rame metallico purissimo in un bicchiere da
250 mL, addizionare lentamente 50 mL di acido nitrico 1:1 (4.5.), far
reagire a temperatura ambiente per 30 min. e quindi completare la
dissoluzione ponendo il bicchiere su piastra calda. Travasare
quantitativamente in un matraccio tarato da 1000 mL e portare a
volume con acido nitrico 10 mL/L (4.6.). Tappare ed omogeneizzare.
4.11. Nichel, soluzione di riferimento a 1000 mg/L di Ni.
Pesare 1,000 g di nichel metallico purissimo in un bicchiere da
250 mL, addizionare lentamente 50 mL di acido nitrico 1:1 (4.5.), far
reagire a temperatura ambiente per 30 min. e quindi completare la
dissoluzione ponendo il bicchiere su piastra calda. Travasare
quantitativamente in un matraccio tarato da 1000 mL e portare a
volume con acido nitrico 10 mL/L (4.6.). Tappare ed omogeneizzare.
4.12. Zinco, soluzione di riferimento a 1000 mg/L di Zn.
Pesare 1,000 g di zinco metallico purissimo in un bicchiere da
250 mL, addizionare lentamente 50 mL di acido cloridrico 1:1 (4.2.),
far reagire a temperatura ambiente per 30 min. e quindi completare la
dissoluzione ponendo il bicchiere su piastra calda. Travasare
quantitativamente in un matraccio tarato da 1000 mL e portare a
volume con acido cloridrico 10 mL/L (4.3.). Tappare ed omogeneizzare.
Nota: E' possibile utilizzare, in alternativa, soluzioni standard
in commercio a titolo garantito (1000 mg/L) di cadmio, cromo, rame,
nichel e zinco.
4.13. Soluzioni di riferimento intermedie.
Prelevare, con buretta di precisione, dalle soluzioni di
riferimento, le aliquote indicate nella seconda colonna della tabella
1 ponendole in un solo matraccio da 500 mL. Portare a volume con
acqua, tappare ed omogeneizzare. La soluzione cosi' ottenuta ha le
concentrazioni indicate nella terza colonna della tabella 1.
Tabella 1
SOLUZIONE DI RIFERIMENTO INTERMEDIA
=====================================================================
Soluzione di |Aliquota da prelevare | Concentrazione
riferimento | (mL) | raggiunta
=====================================================================
4.8. | 12,5 | 25 mg/L Cd
---------------------------------------------------------------------
4.9. | 25,0 | 50 mg/L Cr
---------------------------------------------------------------------
4.10. | 25,0 | 50 mg/L Cu
---------------------------------------------------------------------
4.11. | 25,0 | 50 mg/L Ni
---------------------------------------------------------------------
4.12. | 12,5 | 25 mg/L Zn
4.14 Soluzioni di riferimento finali.
Prelevare, con buretta di precisione, dalle soluzioni riportate
in 4.13., le tre aliquote indicate in tabella 2, ponendole in
altrettanti matracci tarati da 500 mL.
Addizionare a ciascun matraccio 1 mL di acido nitrico concentrato
(4.4.).
Nel caso della soluzione 4.12., addizionare 10 mL di soluzione di
lantanio 10 g/L (4.8.).
Portare quindi a volume di 500 mL con acqua. Tappare ed
omogeneizzare.
Le soluzioni ottenute sono stabili per circa un mese ed hanno le
concentrazioni indicate nella tabella 2.
Tabella 2
SOLUZIONI DI RIFERIMENTO FINALI
==============================================
| Concentrazione raggiunta, mg/L
|---------------------------------
Metallo | Aliquota da prelevare
|---------------------------------
| 10 mL | 20 mL | 40 mL
------------|--------|----------|-------------
Cd.... | 0,5 | 1,0 | 2,0
Cr.... | 1,0 | 2,0 | 4,0
Cu.... | 1,0 | 2,0 | 4,0
Ni.... | 1,0 | 2,0 | 4,0
Zn.... | 0,5 | 1,0 | 2,0
5. Apparecchiatura
Tutta la vetreria graduata utilizzata per l'esecuzione di questa
analisi deve avere una precisione certificata almento equivalente
alla classe "B", meglio se di classe "A".
5.1. Piastra riscaldante.
5.2. Refrigerante di Liebig.
5.3. Spettrofotometro per assorbimento atomico, dotato di
correttore del fondo.
5.4. Lampade e catodo cavo per gli elementi da determinare.
5.5. Gas per l'alimentazione della fiamma (aria o protossido di
azoto e acetilene).
6. Procedimento
6.1. Dissoluzione del campione
Pesare 5 g di campione, preparato secondo quanto previsto dal
Metodo A riportato nella Parte II della raccolta dei metodi ufficiali
di analisi, in beuta di Erlenmeyer da 250 mL con collo smerigliato,
umettare il campione con pochi mL di acqua, addizionare 21 mL di HC1
(4.1.) e 7 mL di HNO in base 3 (4.4.).
Applicare il refrigerante (5.2.) e lasciare a riposo una notte.
Scaldare per due ore su piastra (5.1.) in modo che la zona di
riflusso si collochi a circa 1/3 della lunghezza della canna del
refrigerante.
Interrompere il riscaldamento, lasciare a riposo fino a cessata
ebollizione e lavare la canna del refrigerante con 10 mL di acido
nitrico soluzione (4.6). Travasare quantitativamente la sospensione
in matraccio tarato da 100 mL, raffreddare e portare a volume con
acqua.
Omogeneizzare accuratamente, lasciare decantare e sottoporre ad
analisi la fase liquida.
Preparare contemporaneamente una prova in bianco con i soli
reagenti.
6.2. Curva di taratura
Preparare la curva di calibrazione utilizzando le seguenti
lunghezze d'onda:
Cadmio.. 228,8 nm
Cromo... 357,9 nm
Rame.... 324,8 nm
Nichel.. 232,0 nm
Zinco... 213,9 nm
Predispone sullo strumento la lampada specifica per l'elemento da
dosare selezionando la lunghezza d'onda sopra riportata.
Azzerare lo spettrofotometro con una soluzione preparata diluendo
1 mL di acido nitrico concentrato (4.4.) a 500 mL con acqua.
Rilevare di seguito le assorbanze delle soluzioni di riferimento
e costruire la curva di taratura riportando su carta millimetrata in
ordinata le assorbanze ed in ascissa le relative concentrazioni.
Avvertenze: Per l'analisi del cromo utilizzare una fiamma
protossido di azotoacetilene, Per gli altri elementi la fiamma
aria-acetilene.
Definire per lo strumento in dotazione condizioni tali da
rispettare la proporzionalita' tra l'assorbanza e la concentrazione
delle soluzioni di cui al punto 4.14.
6.3. Dosaggio
Rilevare di seguito le assorbanze delle soluzioni in esame dopo
avere effettuato, se necessario, le eventuali diluizioni.
Riportare i valori di assorbanza sulla curva di calibrazione e
leggere i corrispondenti valori di concentrazione.
7. Espressione dei risultati
La quantita' di metalli estratti, presente nel campione in esame
ed espressa come milligrammi di singolo metallo (C) per chilogrammo,
viene calcolata applicando la seguente espressione:
A · V · D · 1000
C = -----------------
P
dove:
C = concentrazione del metallo nel campione, espressa in mg/kg;
A = concentrazione del metallo, espressa in mg/L, ricavata
dalla curva di calibrazione;
V = volume, espresso in litri, della soluzione in esame (= 0,1);
D = fattore di diluizione;
P = massa del campione sottoposto ad analisi, espressa in grammi.
Nota:
Riportare il dato analitico con una cifra decimale se la
concentrazione e' compresa tra 1 e 20 mg/kg.
Riportare il dato analitico senza cifra decimale se la
concentrazione e' superiore a 20 mg/kg.
8. Limiti di rilevabilita'
Nelle condizioni di riferimento riportate nel presente metodo, i
limiti di rilevabilita' sono i seguenti:
Cadmio.. 1 mg/kg
Cromo... 8 mg/kg
Rame.... 2 mg/kg
Nichel.. 8 mg/kg
Zinco... 1 mg/kg
DETERMINAZIONE DEL PIOMBO TOTALE
NEI FERTILIZZANTI
1. Oggetto
Il presente documento fissa un metodo per la determinazione del
piombo totale, considerando come tale il piombo estraibile con acqua
regia.
2. Campo di applicazione
Il metodo e' applicabile ai concimi nazionali, agli ammendanti ed
ai correttivi.
3. Principio
La solubilizzazione del metallo viene effettuata con soluzione
nitrico-cloridrica a caldo.
La determinazione del metallo estratto viene effettuata mediante
spettrometria di assorbimento atomico con atomizzazione in fiamma.
4. Reattivi
Nel corso dell'analisi utilizzare acqua distillata o
demineralizzata di purezza equivalente e reagenti di qualita'
analitica riconosciuta.
4.1. Acido cloridrico, HC1, al 37% (rho = 1,186).
4.2. Acido nitrico, HNO in base 3, al 65% (rho = 1,40).
4.3. Acido nitrico, HNO in base 3, soluzione 1:1.
Diluire 500 mL di HNO in base 3 (4.2.) con 500 mL di acqua.
4.4. Acido nitrico, HNO in base 3, soluzione 10 mL/L
Diluire 10 mL di HNO in base 3, (4.2.) in un matraccio tarato da
1000 mL con acqua sino a volume.
4.5. Piombo, soluzione standard a 1000 mg/L di Pb.
Pesare g 1 di piombo metallico purissimo con la precisione di
1 mg e porlo in un becher da 250 mL. Addizionare lentamente 50 mL di
HNO in base 3 (4.3.), far reagire a temperatura ambiente per 30
minuti e quindi completare la dissoluzione ponendo il becher su
piastra calda. Travasare quantitativamente in un matraccio tarato da
1000 mL e portare a volume con HNO in base 3 (4.4.). Tappare e
omogeneizzare.
Nota: E' possibile utilizzare, in alternativa, una soluzione
standard di piombo in commercio a titolo garantito (1000 mg/L).
4.6. Soluzione di riferimento intermedia
Dalla soluzione (4.5.) prelevare con una buretta da 50 mL (div.
1/10), 50 mL da trasferire in un matraccio da 500 mL. Portare a
volume con HNO in base 3 (4.4.) ed omogeneizzare. La soluzione
contiene 100 mg/L di Pb.
4.6.1. Soluzioni di riferimento finali
Dalla soluzione 4.6. prelevare con una buretta da 50 mL
10-20-30 mL da trasferire in altrettanti matracci da 250 mL.
Addizionare a ciascun matraccio 5 mL di HNO in base 3 (4.2.) e
portare a volume con acqua. Tappare ed omogeneizzare. Le soluzioni
ottenute contengono rispettivamente 4-8-12 mg/L di Pb. Se conservate
in bottiglie di politene, le soluzioni sono stabili un mese.
5. Apparecchiatura
5.1. Piastra riscaldante.
5.2. Refrigerante di Liebig.
5.3. Spettrofotometro ad assorbimento atomico dotato di sistema
di correzione del fondo.
5.4. Lampada a catodo cavo per piombo.
5.5. Gas per l'alimentazione della fiamma (protossido di azoto -
acetilene).
6. Procedimento
6.1. Preparazione del campione per l'analisi.
Preparare il campione secondo quanto previsto dal Metodo A
riportato nella Parte II della raccolta dei metodi ufficiali di
analisi.
6.2. Dissoluzione del campione
Pesare 5 g di campione in beuta da 250 mL con collo smerigliato,
umettare il campione con pochi mL di acqua, addizionare 21 mL di HC1
(4.1.) e 7 mL di HNO in base 3 (4.2.). Applicare il refrigerante e
lasciare a riposo una notte. Scaldare per 2 ore su piastra (5.1.) in
modo che la zona di riflusso si collochi a circa 1/3 della lunghezza
della canna del refrigerante. Interrompere il riscaldamento, lasciare
a riposo fino a cessata ebollizione e lavare la canna del
refrigerante con 10 mL di HNO in base 3 (4,4.). Travasare
quantitativamente la sospensione in un matraccio da 100 mL,
raffreddare e portare a volume con acqua.
Omogeneizzare accuratamente, filtrare su filtro a basso contenuto
di ceneri scartando le prime frazioni filtrate e quindi sottoporre ad
analisi la fase limpida.
Preparare contemporaneamente un bianco con i soli reattivi.
6.3. Curva di taratura.
Predisporre sullo strumento la lampada specifica del piombo
selezionando la lunghezza d'onda di 217 nm ed attivare il sistema di
correzione del fondo. Azzerare lo strumento con la soluzione in
bianco.
Rilevare le assorbanze delle soluzioni di riferimento (4.6.1.) e
costruire la curva di taratura riportando su carta millimetrata, in
ordinata le assorbanze ed in ascissa le relative concentrazioni.
6.4. Dosaggio.
Rilevare di seguito le assorbanze delle soluzioni in esame dopo
avere effettuato, se necessario, le eventuali diluizioni.
Riportare i valori di assorbanza sulla curva di taratura e
leggere i corrispondenti valori di concentrazione.
7. Espressione dei risultati
Il contenuto di Pb si esprime in mg/kg, con arrotondamento
all'unita' e viene calcolato utilizzando la seguente espressione:
A · V · D · 1000
Pb = -----------------
P
dove:
A = concentrazione del metallo, espressa in mg/L, ricavata
dalla curva di taratura;
V = volume, espresso in litri, della soluzione in esame;
D = fattore di diluizione;
P = massa del campione sottoposto ad analisi, espressa
in grammi.
8. Limiti di rilevabilita'
Nelle condizioni standard sopra riportate, il limite di
rilevabilita' del Pb e' pari a 8 mg/kg. Alla concentrazione di 30
mg/kg, i valori di analisi replicate devono essere compresi
nell'intervallo 30± 3 mg/kg. Nel caso di variabilita' piu' elevata,
occorre ripetere l'analisi ripartendo dalla pesata.
RICONOSCIMENTO DI TORBE, LEONARDITI E LIGNITI
NEI FERTILIZZANTI
1. Oggetto
Il presente documento fissa un metodo per il riconoscimento di
torbe, leonarditi e ligniti nei fertilizzanti.
2. Campo di applicazione
Il metodo e' applicabile agli ammendanti organici naturali.
3. Principio
Il riconoscimento si basa sulle differenze del profilo
elettroforetico ottenuto per isoelettrofocalizzazione della sostanza
organica estratta in sodio idrossido + sodio pirofosfato.
4. Reattivi
Nel corso dell'analisi utilizzare acqua distillata o
demineralizzata di purezza equivalente e reagenti di qualita'
analitica riconosciuta.
4.1. Sodio idrossido, NaOH, > 99%.
4.2. Sodio pirofosfato decaidrato, Na in base 4 P in base 2 O in
base 7 · 10 H in base 2 O, > 99%.
4.3. Soluzione di NaOH 0,1 M e Na in base 4 P in base 2 O in base
7 · 10 H in base 2 O 0,1 M.
Pesare 4 g di NaOH (4.1.) e 44,6 g di Na in base 4 P in base 2 O
in base 7 (4.2.) con una precisione di 0,01 g e porli in un matraccio
tarato da 1000 mL, aggiungere circa 600 mL di acqua, agitare fino
alla completa dissoluzione, portare a volume. Questa soluzione deve
essere conservata in un contenitore dotato di una chiusura ermetica.
Se correttamente conservata la soluzione ha una durata di 2 mesi.
4.4. Acrilammide, CH in base 2 CHCONH in base 2, > 99,9%.
4.5. N,N'-metilene bisacrilammide (Bis), CH in base 2 CHCONHCH in
base 2 NHCOCHCH in base 2, > 99,9%.
4.6. Soluzione di acrilammide: Bis 37,5:1 (30%T, 2,6%C).
Pesare 29,22 g di acrilammide (4.4.) e 0,78 g di Bis (4.5.) con
una precisione di 0,001 g e porli in un matraccio tarato da 100 mL,
aggiungere circa 70 mL di acqua, agitare dolcemente fino alla
completa dissoluzione, portare a volume, omogeneizzare perfettamente
e filtrare su carta. Conservare in un contenitore in polietilene a +
4 oC al massimo per 30 giorni.
4.7. Ampholine(r) a pH 3,5-5,0 Pharmacia LKB (80-1125-89), 0,4
g/mL.
4.8. Ampholine(r) pH 4,0-6,0 Pharmacia LKB (80-1125-90), 0,4
g/mL.
4.9. Ampholine(r) pH 6,0-8,0 Pharmacia LKB (60-1125-93), 0,4
g/mL.
4.10. N,N,N',N'-tetrametiletilenediammina (TEMED), (CH in base 3)
in base 2 NCH in base 2 CH in base 2 N(CH in base 3) in base 2.
4.11.Soluzione di TEMED al 3% v/v
Diluire 6 mL di TEMED (4.10.) in un matraccio tarato da 50 mL con
acqua. Conservare al buio a +4o C al massimo per 2 mesi.
4.12. Ammonio persolfato, (NH in base 4) in base 2 S in base 2 O
in base 8, 98%.
4.13. Soluzione di ammonio persolfato 1,5% p/v
Pesare 0,15 g di ammonio persolfato (4.12.) con una precisione di
0,001 g, porli in un matraccio tarato da 10 mL, portare a volume con
acqua, agitare dolcemente fino alla completa dissoluzione del sale.
Questa soluzione deve essere preparata fresca ogni volta.
4.14. Soluzione di sodio idrossido 0,2 M (catodo)
Pesare 0,8 g di sodio idrossido (4.1.) con una precisione di
0,001 g e metterlo in un matraccio tarato da 100 mL, portare a volume
con acqua, agitare dolcemente fino alla completa dissoluzione.
Filtrare su carta e conservare in un contenitore di polietilene a + 4
oC al massimo per 2 mesi.
4.15. Acido o-fosforico, H in base 3 PO in base 4, 85% (rho
=1,71).
4.16. Soluzione di acido o-fosforico 0,2 M (anodo)
Diluire 1,35 mL di acido o-fosforico (4.15.) in un matraccio
tarato da 100 mL con acqua. Filtrare su carta e conservare in un
contenitore di polietilene a +4 oC al massimo per 2 mesi.
4.17. Repel-Silane(r) ES, dimetildiclorosilano al 2% (p/v) in
ottometil ciclo-ottosilano, Pharmacia (17-1332-01).
4.18. Etanolo, C in base 2 H in base 5 OH, 95 %.
4.19. Acido acetico glaciale, CH in base 3 COOH, 100%.
4.20. Blu brillante R-250 Coomassie, C in base 45 H in base 44 N
in base 3 NaO7,S in base 2.
4.21. Rame (II) solfato pentaidrato, CuSO in base 4.5 H in base 2
O, > 99,5%.
4.22. Soluzione colorante: Blue R-250 0,025%, CuSO in base 4 1%,
etanolo 15%, acido acetico 15%
Pesare 10 g di CuSO in base 4 (4.21.) con una precisione di
0,01 g, porli in un matraccio tarato da l .000 mL, aggiungere 400 mL
di acqua, agitare dolcemente fino alla completa dissoluzione del
sale. Pesare 0,25 g di Blue R-250 (4.20.) con una precisione di
0,001 g e aggiungerlo al matraccio contenente la soluzione di CuSO in
base 4, aggiungere 150 mL di etanolo (4.18.), 150 mL di acido acetico
(4.19.), agitare con un agitatore magnetico rotante fino alla
completa dissoluzione del colorante, portare a volume con acqua e
omogeneizzare. Filtrare su carta e conservare in un contenitore in
vetro con chiusura ermetica. Se correttamente conservata questa
soluzione ha una durata di 2 mesi, ovvero deve essere comunque
sostituita dopo la colorazione di 5 piastre.
4.23. Soluzione fissante: Blue R-250 0,0025%, CuSO in base 4 1%,
etanolo 15%, acido acetico 15%.
Pesare 10 g di CuSO in base 4 (4.21.) con una precisione di
0,01 g, mettere in un matraccio tarato da 1.000 mL, aggiungere 400 mL
di acqua, agitare dolcemente fino alla completa dissoluzione del
sale. Pesare 0,025 g di Blue R-250 (4.20.) con una precisione di
0,001 g e aggiungerlo al matraccio contenente la soluzione di CuSO in
base 4, addizionare 150 mL di etanolo (4.18.) e 150 mL di acido
acetico (4.19.), agitare con un agitatore magnetico rotante fino alla
completa dissoluzione del colorante, portare a volume con acqua.
Filtrare su carta e conservare in un contenitore in vetro con
chiusura ermetica. Se correttamente conservata questa soluzione ha
una durata di 2 mesi, ovvero deve essere comunque sostituita dopo la
colorazione di 5 piastre.
4.24. Soluzione decolorante: etanolo 10%, acido acetico 10%.
Diluire 100 mL di etanolo (4.18.) e 100 mL di acido acetico
(4.19.) in un matraccio tarato da l .000 mL con acqua, agitare
dolcemente fino alla completa omogeneizzazione. Conservare in un
contenitore di polietilene con chiusura ermetica al massimo per 2
mesi.
4.25. Acido cloridrico, HC1, 35% (p/p).
4.26. Soluzione di acido cloridrico 3 M.
Diluire 250 mL di acido cloridrico (4.25.) in un matraccio tarato
da l .000 mL con acqua, agitare dolcemente fino alla completa
omogeneizzazione. Conservare in un contenitore di polietilene con
chiusura ermetica al massimo per 2 mesi.
5. Apparecchiatura
5.1. Tubi da dialisi in cellulosa rigenerata con pori di
dimensioni molecolari nominali di 1.000 daltons.
5.2. Liofilizzatore.
5.3. Lastre in vetro 125x260x3 mm.
5.4. Lastre in vetro 125x260x3 mm con guarnizione a U dello
spessore di 0,5 mm.
5.5. Pinze (n. 4) con guarnizioni in gomma per lastre dello
spessore 0,5 mm.
5.6. GelBond(r) PAG film, 124x258 mm, con una superficie idrofila
ed una idrofoba, Pharmacia (80-1129-36).
5.7. Cella elettroforetica orizzontale con piatto refrigerabile
in ceramica 210x270 mm ed elettrodi al platino.
5.8. Criostato a circolazione di acqua del tipo con capacita'
refrigerante 200 W a 5 oC, capacita' pompa: pressione 0,3 bar,
flusso = 12 L/min, intervallo di lavoro: -10 ÷ + 90 oC.
5.9. Alimentatore, intervallo di tensione: 35-3500 V, corrente
massima: 400 mA, potenza massima 200 W.
5.10. IEF electrode strip, Pharmacia (18-1013-73).
5.11. pHmetro dotato di elettrodo per misure di superficie.
5.12. Densitometro laser (lambda = 633 nm).
5.13. Fogli di cellophane 210x320 mm, Pharmacia (80-1129-38).
6. Procedimento
6.1 Preparazione del campione per l'analisi.
Preparare il campione secondo quanto previsto dal Metodo A
riportato nella Parte II della raccolta dei metodi ufficiali di
analisi.
6.2 Estrazione della sostanza organica.
Estrarre la sostanza organica secondo quanto previsto dal decreto
ministeriale 21 dicembre 2000 "Metodi ufficiali di analisi dei
fertilizzanti. Supplemento n. 6" Gazzetta Ufficiale n. 21 del 26
gennaio 2001.
6.3 Purificazione della sostanza organica estratta.
Neutralizzare 20 mL di estratto (6.2.) con HC1 (4.26.), quindi
porre la soluzione in un tubo da dialisi (5.1.) lungo circa 30 cm e
immergere un'estremita' all'interno di una vasca contenente acqua.
Cambiare l'acqua della vasca ogni 12 ore per almeno 3 giorni.
Controllare il termine della dialisi verificando con una cartina al
tornasole che il ph dell'estratto contenuto nel tubo e quello della
acqua nella vasca siano uguali. Terminata la dialisi, liofilizzare
(5.2.) la sostanza organica estratta e purificata. Pesare 5 mg di
liofilizzato,porli in una microprovetta tipo Eppendorf da 1,5 mL e
aggiungere l mL di acqua, agitare dolcemente fino alla dissoluzione
del liofilizzato, conservare a -16 oC. I campioni possono essere
conservati fino a 2 mesi.
6.4 Preparazione della piastra.
Fare aderire alla lastra in vetro (5.3.) la faccia idrofoba del
supporto per gel tipo GelBond (5.5.) con alcune gocce d'acqua.
Montare la piastra unendo la faccia trattata con il Repel silane
(4.18.) della lastra dalla guarnizione a U (5.4.) con la faccia della
lastra di vetro (5.3.) dove e' stato fatto aderire il GelBond
bloccando la piastra con le apposite pinze (5.5.).
6.5. Preparazione del gel di poliacrilammide (5%T, 2,6%C).
In una beuta da 150 mL mettere nell'ordine: 4,15 mL di soluzione
di acrilammide-Bis (4.7.), 0,72 mL di Ampholine 3,5-5,0 (4.8.), 0,24
mL di Ampholine 4,0-6,0 (4.9.), 0,24 mL di Ampholine 6,0-8,0 (4.10.),
0,35 mL di soluzione di TEMED (4.12.), 18,4 mL di acqua e 0,9 mL di
soluzione di ammonio persolfato (4.14.); mescolare bene per circa un
minuto senza provocare la formazione di bolle d'aria all'interno
della soluzione, eventualmente insufflare azoto per un minuto.
Versare molto lentamente la soluzione nella fessura della piastra con
una pipetta o una siringa evitando la formazione di bolle d'aria.
Lasciare gelificare al buio, a temperatura ambiente per l ora.
Conservare al buio a +4 oC al massimo per 48 ore.
6.6. Isoelettrofocalizzazione.
Reidratare il gel (6.5.) versando alcune gocce d'acqua nella
fessura della piastra.
Disporre il gel nella cella elettroforetica (5.7.) mantenendola a
+2 oC con il criostato (5.8.), disporre sul gel due strisce di strip
(5.10.) ai due bordi lunghi del gel, una (catodo) imbibita con la
soluzione di sodio idrossido (4.15.) e l'altra (anodo) con la
soluzione di acido fosforico (4.17.), collegare gli elettrodi della
cella con gli strip e chiudere il circuito. Accendere l'alimentatore
(5.9.) della cella e impostare le seguenti condizioni di precorsa:
- tensione (massima): 1.200 V;
- intensita': 0,9 mA/cm;
- potenza: 0,6 W/cm;
- tempo: 3 ore.
Trascorse le 3 ore di precorsa, interrompere l'alimentazione,
disporre sul gel, a circa 0,5 cm dallo strip contenente la soluzione
di sodio idrossido (catodo), dei rettangoli di strip lunghi circa 1
cm e distanti l'uno dall'altro circa 0,5 cm, deporre 20-50 µL di
campione (6.3.), portare a completa imbibizione i rettangoli di strip
con acqua, rimontare la cella, riaccendere l'alimentare e impostare
le seguenti condizioni di corsa:
- tensione (massima): 1.200V;
- intensita': 0,9 mA/cm;
- potenza: 0,6 W/cm;
- tempo: 2 ore.
Trascorse le 2 ore interrompere l'alimentazione, togliere il gel
dalla cella e misurare, con il piaccametro (5.11.), il pH della
superficie del gel facendo letture ad intervalli di 0,5 cm dall'anodo
verso il catodo, registrare i valori delle letture e la distanza
dall'anodo.
6.7. Colorazione del gel
Riempire una vaschetta con la soluzione colorante (4.23.) e
immergervi il gel, agitare dolcemente per 1 ora, sostituire la
soluzione colorante con quella fissante (4.24.) agitare dolcemente
per l2 ore, togliere la soluzione fissante ed eliminare il colorante
in eccesso con ripetuti lavaggi con la soluzione decolorante (4.24.).
6.8. Scansione del gel
Misurare l'intensita' delle bande colorate con un densitometro
laser (5.12.) (lambda = 633 nm) e registrare il profilo dall'anodo al
catodo.
6.9. Conservazione del gel
Avvolgere il gel nella apposita busta di cellophane (5.13.)
facendo attenzione a formare il minor numero possibile di bolle
d'aria, seccarlo all'aria mantenendolo sotto tensione per alcuni
giorni e conservare il gel seccato in ambiente pulito e secco. Se
correttamente seccato e conservato il gel mantiene le bande colorate
per 1 anno.
7. Espressione dei risultati
Il riconoscimento di torbe, leonarditi e ligniti si basa sul
confronto dei rispettivi profili di elettrofocalizzazione a 633 nm.
Le torbe (Fig. 1) sono caratterizzate da una banda molto intensa
a pH 3,5, seguita da una poco intensa a pH 3,8 (regione A) e da un
gruppo di bande (almeno 5 ben distinte) a pH compreso tra 4,0 e 4,4
(regione B); non sono presenti bande intense e ben focalizzate a
pH > 4,4 (regione C). Le regioni A e B sono quelle che hanno
la maggiore area relativa del profilo elettroforetico (Tab. 1).
Le leonarditi (Fig. 1) presentano una banda molto intensa a pH
3,5, seguita da una poco intensa a pH 3,8 (regione A);
nell'intervallo di pH compreso tra pH 3,8 e 4,4 (regione B) sono
presenti un gruppo di bande ben focalizzate (almeno 5), fra le quali
quella a pH maggiore e' sempre la piu' intensa del gruppo;
nell'intervallo di ph compreso fra 4,4 e 6,0 (regione C) e' sempre
presente un gruppo di bande molto intense (almeno 5). La regione C ha
un'area relativa del profilo elettroforetico del 67% (Tab. 1), mentre
le regioni A e B hanno un'area relativa del 14 e 19%, rispettivamente
(Tab. 1).
Le ligniti (Fig. 1) hanno un picco a pH 3,5 meno intenso rispetto
alle torbe e alle leonarditi; nell'intervallo tra pH 3,8 e 4,4
(regione B) presentano bande poco intense e poco focalizzate, mentre
nella regione a pH > 4,4 (regione C) presentano un gruppo di bande
focalizzate abbastanza intense (sono riconoscibili almeno 4 bande).
La regione C ha un'area relativa del 81% (Tab. 1), mentre le regioni
A e B hanno un'area relativa del 8 e 11% rispettivamente (Tab. 1).
Figura 1 - Confronto tra i profili di elettrofocalizzazione di una
torba, una leonardite e una lignite.
Tabella 1
AREA RELATIVA DELLE DIVERSE REGIONI
DEL PROFILO ELETTROFORETICO
=====================================================================
| | Regione del profilo elettroforetico
Matrice | N. |----------------------------------------------------
| | A (pH 3,5-3,8) | B (pH 3,8-4,4) | C (pH 4,4-6,0)
-----------|----|-----------------|----------------|-----------------
Torbe.... | 31 | 51,3 ± 9,7 (1) | 45,1 ± 6,9 | 3,6 ± 9,1
Leonarditi.| 15 | 13,9 ± 5,0 | 19,5 ± 6,9 | 66,7 ± 10,0
Ligniti....| 5 | 7,6 ± 0,9 | 11,3 ± 4,1 | 81,0 ± 4,6
(1) Media ± deviazione standard.
DETERMINAZIONE DEL GRADO DI RACEMIZZAZIONE
NEI FERTILIZZANTI
1. Oggetto
Il presente documento fissa un metodo per la determinazione del
grado di racemizzazione, considerando come tale, il rapporto
percentuale tra la forma D (R) dell'alanina libera rispetto alla
somma delle forme L (S) e D (R) dell'alanina libera.
2. Campo di applicazione
Il metodo e' applicabile ai concimi organici azotati fluidi ed
agli ammendanti per i quali e' richiesta la dichiarazione del grado
di racemizzazione.
3. Principio
La separazione degli enantiomeri viene effettuata per
elettroforesi capillare utilizzando la beta-ciclodestrina come
selettore chirale.
4. Reattivi
Nel corso dell'analisi utilizzare acqua distillata o
demineralizzata di purezza equivalente e reagenti di qualita'
analitica riconosciuta.
4.1. Tampone Tris(idrossimetil)-amminometano (TRIS) 0,1 M/borato
0,1 M + acido etilendiamminotetracetico (EDTA) 2,5 mM + sodio
dodecilsolfato (SDS) 0,1% + urea 7 M, pH 8,6 (Fluka, 82616).
4.2. beta-ciclodestrina, C in base 42 H in base 70 O in base 35,
> 99%.
4.3. Tampone per elettroforesi capillare
Disciogliere in 100 mL del tampone (4.1.) 1,135 g di
beta-ciclodestrine (4.2.), agitare dolcemente fino alla completa
dissoluzione, conservare a + 4 oC. Se correttamente conservata ha una
durata di 2 mesi.
4.4. Acetonitrile (ACN), CH in base 3 CN, > 99,8%.
4.5. Dansil cloruro, 5-dimetilamminonaftalene 1-sufonil cloruro
(DNS-Cl), > 99%.
4.6. Dansil cloruro, soluzione 15 mM in acetonitrile
Disciogliere in 5 mL di ACN (4.4.) 20 mg di DNS-C1 (4.5.), questa
soluzione deve essere preparata fresca ogni volta.
4.7. Sodio bicarbonato, NaHCO in base 3, > 99,8%.
4.8. Sodio bicarbonato, NaHCO in base 3 soluzione 0,5 M
Pesare 36 g di sodio bicarbonato (4.7.) con una precisione di
0,01 g e porlo in un pallone tarato da 1 L, aggiungere circa 600 mL
di acqua, agitare fino alla completa dissoluzione del bicarbonato,
quindi portare a volume. La soluzione deve essere conservata in un
contenitore dotato di una chiusura ermetica e mantenuta a + 4 oC. Se
correttamente conservata la soluzione ha una durata di 2 mesi.
4.9. L (S) alanina, CH in base 3 CH(NH in base 2)CO in base 2 H,
99%.
4.10. D (R) alanina, CH in base 3 CH(NH in base 2)CO in base 2 H,
99%.
4.11. L (S) D (R) alanina, CH in base 3 CH(NH in base 2)CO in
base 2 H, 99%.
4.12. L (S) alanina soluzione 10 mM.
Pesare 0,089 g di L (S) alanina (4.9.) con una precisione di 1
mg, porla in un pallone tarato da 100 mL, aggiungere circa 60 mL di
acqua, agitare fino alla completa dissoluzione, portare a volume. La
soluzione deve essere conservata in un contenitore con chiusura
ermetica e mantenuta a -16 oC. Se correttamente conservata la
soluzione ha una durata di 2 mesi.
4.13. D (R) alanina soluzione 10 mM.
Pesare 0,089 mg di D (R) alanina (4.10.) con una precisione di
1 mg, porla in un pallone tarato da 100 mL, aggiungere circa 60 mL di
acqua, agitare fino alla completa dissoluzione, portare a volume. La
soluzione deve essere conservata in un contenitore con chiusura
ermetica e mantenuta a -16 oC. Se correttamente conservata la
soluzione ha una durata di 2 mesi.
4.14. L (S) D (R) alanina soluzione 10 mM
Pesare 0,089 mg di L (S) D (R) alanina (4.9) con una precisione
di 1 mg, porla in un pallone tarato da 100 mL, aggiungere circa 60 mL
di acqua, agitare fino alla completa dissoluzione, portare a volume.
La soluzione deve essere conservata in un contenitore con chiusura
ermetica e mantenuta a -16 oC. Se correttamente conservata la
soluzione ha una durata di 2 mesi.
5. Apparecchiatura
5.1. Stufa o agitatore riscaldante a bagno d'acqua.
5.2. Centrifuga per microprovette.
5.3. Siringhe da l mL tipo usa e getta.
5.4. Filtri da siringa da 1 mL con pori del diametro di 0,45 µm
in politetrafluoroetilene idrofilo (PTFE).
5.5. Elettroforesi capillare con rilevatore spettrofotometrico
dotato di una lampada al deuterio e di un programma d'integrazione e
calcolo delle aree dei picchi degli elettroferogrammi.
5.6. Capillare in silice fusa, rivestito esternamente con
poliimmide ed internamente con poliacrilammide (BIOCAPTM XL,
148-3081, BIO-RAD) di lunghezza totale (TL) di 50 cm e di lunghezza
effettiva al rilevatore (EL) 45,4 cm, con diametro interno (ID) di 50
µm e diametro esterno (OD) di 375 µm.
6. Procedimento
6.1. Preparazione del campione per l'analisi.
Pesare una quantita' compresa tra 50-100 mg di campione
all'interno di una microprovetta tipo Eppendorf da 1,5 mL con tappo,
quindi aggiungere 1 mL di acqua, tappare la microprovetta ed agitare
fino alla completa dissoluzione.
6.2. Derivatizzazione del campione.
In una microprovetta con tappo tipo Eppendorf da 0,5 mL
aggiungere nell'ordine 10-50 µL di campione (6.1), 50 µL di soluzione
di bicarbonato (4.8), 150 µL di soluzione di dansil cloruro (4.6) e
acqua in quantita' tale da portare il volume totale a 250 µL.
Omogeneizzare il tutto agitando dolcemente per alcuni minuti, quindi
porre nell'agitatore riscaldante a bagno d'acqua (5.1) a 65 0C per 45
minuti. Trascorso questo tempo togliere i campioni dall'agitatore,
lasciarli raffreddare a temperatura ambiente al buio, quindi
centrifugarli (5.2) a 5.000. g per 10 minuti a 4 oC. Prelevare il
surnatante con una siringa (5.3) e filtrarlo (5.4) recuperando il
campione derivatizzato nelle apposite microprovette per elettroforesi
capillare.
A parte, derivatizzare insieme al campione, in microprovette
separate, 10 µL delle soluzioni di L (S) alanina (4.12), D (R)
alanina (4.13) e L (S) D (R) alanina (4.14). Questi tre campioni
marcati servono per il preciso riconoscimento dei picchi della L (S)
e D (R) alanina del campione.
6.3 Elettroforesi capillare.
Installare nello strumento (5.5) il capillare (5.6) e
condizionarlo lavandolo con acqua per 10 minuti e tampone (4.3) per 5
minuti sotto alta pressione (7 bar). Procedere all'analisi dei
campioni predisponendo le seguenti condizioni:
campo elettrico (costante) = 300 V . cm elevato a -1;
polarita': da - a +;
intensita' (limite): 50 mA;
rilevazione: lambda = 240-260 nm;
iniezione campione: 2 psi · s = 30,4 Pa · s = 0,23 mm Hg ·
s =
3-10 elevato a -4 bar · s;
tempo di corsa: 35 minuti;
temperatura capillare: 25 oC.
Prima di ogni corsa lavare il capillare sotto alta pressione (7
bar) con acqua per 3 minuti e tampone (4.3) per 2 minuti.
Il riconoscimento dei picchi della L (S) alanina e D (R) alanina
deve essere fatto confrontando gli elettroferogrammi del campione da
solo con quelli del campione marcato. Le aree dei picchi dei due
enantiomeri devono essere valutate per mezzo di un idoneo programma
di integrazione e calcolo.
7. Espressione dei risultati
Il Grado di racemizzazione si esprime in percentuale ed e'
calcolato utilizzando la seguente espressione:
Grado di racemizzazione (%)
area picco D(R) alanina
=2 · ---------------------------------------------------- · 100
area picco D(R) alanina + area picco L(S) alanina}
Nota: Il fattore di trasformazione 2 deriva dall'accezione di
racemo che, ai fini del presente metodo, viene definito come miscela
proveniente da una racemizzazione spinta, a seguito della quale il
rapporto dei due enantiomeri D/L e' superiore a 0,5.
DETERMINAZIONE DELLE MASSE MOLECOLARI NOMINALI
(NMW) < 10.000 DALTONS NEI FERTILIZZANTI
A BASE DI PROTEINE IDROLIZZATE.
1. Oggetto
Il presente documento fissa un metodo per la determinazione delle
masse molecolari (NMW) prendendo come riferimento un cut-off a 10.000
daltons.
Nota: Il presente metodo puo' essere applicato anche per la
determinazione di masse molecolari (NMW) diverse (per es. 1.000,
5.000, 20.000 daltons).
2. Campo di applicazione
Il metodo e' applicabile ai fertilizzanti organici azotati fluidi
per i quali e' richiesta la dichiarazione delle masse molecolari.
3. Principio
La separazione delle NMW viene effettuata per ultrafiltrazione
con membrane di esteri di cellulosa (CE), con pori di dimensione
molecolare nominale (NMW) diverse, in questo caso di 10.000 daltons
(2,5 nm) in condizioni di pH e forza ionica costanti, sotto flusso di
gas inerte a +4oC.
4. Reattivi
Nel corso dell'analisi utilizzare acqua distillata o
demineralizzata di purezza equivalente e reagenti di qualita'
analitica riconosciuta.
4.1. Potassio cloruro, KC1, > 99,5%.
4.2. Potassio cloruro, KC1 soluzione 10 mM
Pesare 0,746 g di potassio cloruro (4.1) con una precisione di
0,001 g e porli in un pallone tarato da 1 L, aggiungere circa 600 mL
di acqua, agitare fino alla completa dissoluzione, portare a volume.
La soluzione deve essere conservata in un contenitore dotato di
chiusura ermetica e a +4oC. Se correttamente conservata la soluzione
ha una durata di 2 mesi.
4.3. o-ftalaldeide (OPA), C in base 8 H in base 6 O in base 2.
4.4. Sodio tetraborato decaidrato, Na in base 2 B in base 4 O in
base 7 · 10 H in base 2 O, > 99%.
4.5. Soluzione di sodio tetraborato 0,2 M
Pesare 19,07 g di sodio tetraborato decaidrato (4.4) con una
precisione di 0,01 g, in un matraccio tarato da 1000 mL e portare a
volume con acqua. La soluzione deve essere conservata in un
contenitore dotato di una chiusura ermetica e mantenuta a + 4oC. La
soluzione, se correttamente conservata, puo' essere utilizzata per 2
mesi.
4.6. Acido borico, H in base 3 BO in base 3, > 99,8%.
4.7. Soluzione di acido borico 0,2 M
Pesare 12,36 g di acido borico (4.6) con una precisione di 0,01
g, in un matraccio tarato da 1000 mL e portare a volume con acqua. La
soluzione deve essere conservata in un contenitore dotato di una
chiusura ermetica e mantenuta a +4 oC. Se correttamente conservata la
soluzione ha una durata di 2 mesi.
4.8. Tampone acido borico-borato, pH 9.
In un matraccio tarato da 200 mL, miscelare 50 mL soluzione di
acido borico (4.7) con 59 mL di soluzione di sodio tetraborato (4.5),
portare a volume con acqua. La soluzione deve essere conservata in un
contenitore dotato di una chiusura ermetica e mantenuta a + 4 oC. Se
correttamente conservata la soluzione ha una durata di 2 mesi.
4.9. Etanolo, C in base 2 H in base 5 OH, 95% v/v.
4.10. Soluzione di OPA
In una provetta di vetro da 10 mL con chiusura ermetica mettere
nell'ordine: 2 mL di etanolo (4.9), una punta di spatola di OPA (4.3)
e 5 mL di tampone acido borico-borato (4.8). Tappare e agitare
dolcemente fino alla completa dissoluzione dell'OPA. Questa soluzione
deve essere conservata al buio a +4 oC ed e' necessario prepararla
fresca ogni volta.
4.11. Acido solforico, H in base 2 SO in base 4 al 96% (p =
1,89).
4.12. Soluzione di acido solforico 2 M
Diluire con acqua 110 mL di acido solforico (4.11) in un
matraccio tarato da 1000 mL sino a volume. La soluzione deve essere
conservata in un contenitore dotato di una chiusura ermetica. Se
correttamente conservata la soluzione ha una durata di 2 mesi.
5. Apparecchiatura
5.1. Cella da ultrafiltrazione con una capacita' di 10 mL.
5.2. Filtri da ultrafiltrazione in esteri di cellulosa (CE) con
NMW da 10.000 daltons.
5.3. Gas inerte per forzare la filtrazione (elio).
5.4. Camera fredda o criostato a + 4 oC.
6. Procedimento
6.1 Preparazione del campione per l'analisi
Omogeneizzare accuratamente il campione, pesare 10 g di campione
con una precisione di 0,01 g all'interno di un matraccio tarato da
100 mL, quindi portare a volume con la soluzione di KC1 (4.2) e
agitare fino alla completa omogeneizzazione.
6.2 Condizionamento della membrana
Installare la membrana nella cella avendo cura di non
danneggiarla, quindi condizionarla facendovi passare attraverso un
opportuno volume di soluzione di KC1 (4.2), in genere e' sufficiente
un volume pari a 5 volte la capacita' della cella. L'ultrafiltrazione
deve essere eseguita sotto flusso di un gas inerte (elio) e a
temperatura costante (+ 4 oC).
6.3 Ultrafiltrazione
Mettere nella cella (5.1) 2 mL di campione (6.1), pari a 200 mg
di campione iniziale ed aggiungere KC1 (4.2) fino a riempire la
cella. Recuperare l'eluato (< 10.000 daltons) dalla cella in un
matraccio tarato da 100 mL contenente 5 mL di soluzione di H in base
2 SO in base 4 (4.12). Man mano che la cella si vuota deve essere
nuovamente riempita con la soluzione di KC1 (4.2). Il termine del
passaggio di materiale organico azotato con massa molecolare < 10.000
daltons viene valutato recuperando alcune gocce dell'eluito dalla
cella all'interno di una provetta di vetro dotata di tappo e
aggiungendovi 1 mL della soluzione di OPA (4.10). Dopo aver agitato
dolcemente la provetta per un minuto, riporla al buio a + 4 oC per 20
minuti, trascorsi i quali controllare il colore della soluzione
contro quello della soluzione di OPA (4.10). Se il colore della
soluzione contenente le gocce di eluito e' piu' scura di quella di
OPA (4.10) continuare l'ultrafiltrazione, se non e' possibile notare
a vista alcuna differenza l'ultrafiltrazione puo' essere considerata
conclusa. Quindi terminata l'ultrafiltrazione portare a volume il
matraccio contenente la frazione eluita (< 10.000 daltons) e
recuperare in modo quantitativo in un matraccio da 100 mL la frazione
(> 10.000 daltons) di campione rimasta nella cella, utilizzando
sempre la soluzione di KC1 (4.2).
6.4 Determinazione del contenuto in azoto organico e carbonio
organico
Sul campione iniziale e su entrambe le frazioni ottenute
determinare:
- il contenuto in azoto organico (sottrarre dal valore
dell'azoto totale il valore dell'azoto ammoniacale e nitrico) secondo
quanto previsto dal Metodo 2 riportato nella Parte Prima (Metodi di
analisi CEE) del decreto ministeriale 24 marzo 1986 "Approvazione dei
metodi ufficiali di analisi per i fertilizzanti" supplemento
ordinario alla Gazzetta Ufficiale n. 180 del 5 agosto 1986;
- il contenuto in carbonio organico secondo quanto previsto dal
decreto ministeriale 21 dicembre 2000 "Metodi ufficiali di analisi
dei fertilizzanti. Supplemento n. 6" Gazzetta Ufficiale n. 21 del
26 gennaio 2001.
7. Espressione dei risultati
Le masse molecolari si esprimono mediando i valori del contenuto
in azoto organico (Norg) e del carbonio organico (Corg) di ogni
frazione (>10kDa e <10kDa), espressi in percentuale sui rispettivi
contenuti totali:
Norg <10kDa(%) Corg <10kDa(%)
--------------- + --------------
Norg totale(%) Corg totale(%)
Frazione <10kDa = ---------------------------------- · 100
2
Norg >10kDa(%) Corg >10kDa(%)
--------------- + --------------
Norg totale(%) Corg totale(%)
Frazione >10kDa = ---------------------------------- · 100
2
DETERMINAZIONE DEL pH NEI FERTILIZZANTI
ED AMMENDANTI ORGANICI
1. Oggetto
Il presente documento fissa un metodo per la determinazione del
grado di reazione (pH) nei fertilizzanti e negli ammendanti organici.
2. Campo di applicazione
Il metodo e' applicabile a tutti i fertilizzanti ed ammendanti
organici.
3. Principio
Il pH viene determinato per via potenziometrica, dopo taratura
del sistema di misura, su sospensioni di:
- fertilizzante-acqua: il valore ottenuto e' indicativo del
grado di reazione del sistema;
- fertilizzante-CaC1 in base 2: il valore ottenuto e'
virtualmente indipendente dal contenuto iniziale in sali presenti nel
campione.
4. Reattivi
Nel corso dell'analisi utilizzare acqua distillata o
demineralizzata di purezza equivalente e reagenti di qualita'
analitica riconosciuta.
4.1. Soluzioni tampone del commercio pronte all'uso (pH = 4, 7 e
10).
4.2. Soluzione di calcio cloruro (0,01 M): sciogliere in H in
base 2 O, in un matraccio tarato da 1000 mL, 1,11 g di calcio cloruro
(CaC1 in base 2) (o 1,47 g di CaC1 in base 2 · 2H in base 2 O).
5. Apparecchiatura
Attrezzatura di laboratorio di uso comune. In particolare:
5.1. pH-metro con compensazione della temperatura, elettrodo di
vetro con elettrodo di riferimento o elettrodi combinati.
5.2. Agitatore magnetico a velocita' regolabile.
5.3. Beaker in vetro da 100 mL.
5.4. Ancorette magnetiche.
5.5. Bilancia tecnica elettronica (unita' di formato almeno 0,1
g).
6. Procedimento
6.1. Taratura del pH-metro
Tarare il sistema di misura utilizzando le soluzioni tampone di
riferimento aventi pH inferiore e superiore a quello del campione.
6.2. Misurazione del pH (in H in base 2 O e CaC1 in base 2)
In un beaker da 100 mL, pesare 3,0 g di campione preventivamente
seccato all'aria, accuratamente omogeneizzato, od una quantita'
equivalente di campione umido. Aggiungere 50 mL di H in base 2 O
distillata o 50 mL della soluzione di CaC1 in base 2 0,01M. Pone in
agitazione per 30 minuti a temperatura ambiente. Lasciare sedimentare
la sospensione per alcuni minuti. Introdurre il sistema elettrodico
del pH-metro nel surnatante e rilevare il valore di pH.
7. Espressione dei risultati
Per il pH determinato in acqua, riportare il risultato come "pH
in H in base 2 O".
Per il pH determinato in soluzione salina, riportare il risultato
come "PH in CaC1 in base 2".
8. Note
I valori di pH determinati in CaC1 in base 2 sono generalmente
inferiori di circa 0,5-0,8 unita' di pH rispetto a quelli rilevati in
H in base 2 O.
Nel caso di matrici organiche particolarmente fibrose (come le
torbe da sfagno) e' possibile variare il rapporto di estrazione
solido:liquido (es. 3 g in 70 mL).
DETERMINAZIONE DELLA SALINITA' NEI FERTILIZZANTI
ED AMMENDANTI ORGANICI
1. Oggetto
Il presente documento fissa un metodo per la determinazione della
salinita' nei fertilizzanti e negli ammendanti organici.
2. Campo di applicazione
Il metodo e' applicabile a tutti i fertilizzanti ed ammendanti
organici.
3. Principio
Il metodo consiste nella determinazione diretta della
conducibilita' (o conduttanza) della sospensione in acqua del
fertilizzante o dell'ammendante organico. Il contenuto in sali e'
infatti correlato alla conducibilita' elettrica della sospensione
acquosa.
4. Reattivi
Nel corso dell'analisi utilizzare acqua bidistillata di purezza
equivalente e reagenti di qualita' analitica riconosciuta.
4.1. Soluzioni standard di potassio cloruro (0,1 M; 0,02 M;
0,002 M).
Soluzione 0,1 M di KC1: sciogliere in H in base 2 O, in un
matraccio tarato da 1000 mL, 7,455 g di potassio cloruro (KC1).
Portare a volume con H in base 2 O.
Soluzione 0,02 M di KC1: prelevare, in un matraccio tarato da
1000 mL, 200 mL della soluzione di KC1 0,1 M. Portare a volume con H
in base 2 O.
Soluzione 0,002 M di KC1: prelevare, in un matraccio tarato da
1000 mL, 20 mL della soluzione di KC1 0,1 M. Portare a volume con H
in base 2 O.
5. Apparecchiatura
Attrezzatura di laboratorio di uso comune. In particolare:
5.1. Matracci tarati di classe A da 1000 mL.
5.2. Pipette tarate di classe A da 20 mL.
5.3. Cilindri tarati di classe A da 100 mL.
5.4. Agitatore oscillante a 120-140 cicli/minuto.
5.5. Contenitori in plastica da 200 mL con tappo a chiusura
ermetica.
5.6. Imbuti in plastica.
5.7. Filtri di carta Whatman(r) n. 42.
5.8. Conduttometro con cella di misura.
5.9. Bilancia tecnica elettronica (unita' di formato almeno 0,1
g).
6. Procedimento
6.1. Pesare 10,0 g di campione umido e porli nel contenitore in
plastica. Aggiungere 100 mL di H in base 2 O bidistillata ed agitare
meccanicamente per 30 minuti. Lasciare decantare la sospensione per
almeno 30 minuti. Se il liquido surnatante risulta sufficientemente
limpido, misurarne direttamente la conducibilita'. Se il surnatante
si presenta torbido, filtrare su filtro di carta Whatman(r) asciutto,
avendo cura di scartare la prima porzione di filtrato. Se il filtrato
risulta ancora torbido, filtrare nuovamente sullo stesso filtro.
6.2. Misurazione della conducibilita'
Utilizzando una apparecchiatura in grado di fornire i valori di
conducibilita' (conduttivita' a 25 oC), e' sufficiente rilevare il
valore accertato, espresso in dSx m elevato a -1. Nel caso in cui
l'apparecchiatura fornisca i valori di conduttanza e' necessario,
mediante l'utilizzo delle soluzioni standard di KC1 preparate,
calcolare il fattore di cella (K). Successivamente, e' possibile
risalire al valore di conducibilita' (conduttivita' a 25 oC),
introducendo nel calcolo un opportuno fattore di correzione (F).
6.3. Calcolo della costante di cella (K)
La costante si ricava misurando soluzioni a conduttivita' nota.
Nella Tabella l vengono riportate le conducibilita' specifiche di
soluzioni di KC1 a varie temperature (in dSx m elevato a -1).
Tabella 1. Conduttivita' di soluzioni di KC1 a diverse
concentrazioni ed a differenti temperature. Per valori intermedi di
T, i valori di conducibilita' specifica si ottengono per
interpolazione.
=====================================================================
Temperatura (T) | 0,1 N | 0,02 N | 0,002 N
=====================================================================
15 | 10,48 | 2,243 | 0,239
20 | 11,67 | 2,501 | 0,266
25 | 12,88 | 2,765 | 0,293
30 | 14,12 | 3,031 | 0,321
Per il calcolo della costante di cella si utilizza la seguente
espressione:
L
K = -----
C
dove:
K = costante di cella
L = conduttività delle soluzioni standard di KC1.
C = conduttanza misurata di una delle soluzioni
standard di KC1.
6.4. Correzione della lettura (F)
La conducibilita' letta per il campione in esame deve essere
corretta per la temperatura. In tabella 2 sono riportati i fattori di
conversione (F) in funzione della temperatura.
Tabella 2. Fattori di conversione F.
=====================================================================
Temperatura | F | Temperatura | F
=====================================================================
5 | 1,613 | 20 | 1,112
10 | 1,411 | 25 | 1,000
15 | 1,247 | 30 | 0,907
7. Espressione dei risultati
Per il calcolo della conducibilita' si utilizza la seguente
espressione:
Lx = C x F x K
dove:
Lx = conduttività a 25 °C della sospensione in esame
C = conduttanza misurata (nelle condizioni operative)
K = costante di cella
F = fattore di conversione della temperatura
Calcolare la salinita' (in meq x 100 g) indirettamente, tenendo
conto che una conducibilita' di 1 dSx m elevato a -1 corrisponde a
circa 12,5 meq x L di sali, mediante la seguente formula:
[(V x 1,25 x Lx)/P] x f
.sp,
dove:
V = volume del liquido (espresso in millilitri)
P = la massa del campione umido (espresso in grammi)
Lx = conduttività a 25 °C della sospensione in esame
f = fattore analitico per riportare il dato analitico
alla sostanza secca {f=100/100-umidità %)}
Nel caso specifico, poiche' l'estratto acquoso e' 10 g/100 mL, la
formula diventa:
12,5 x Lx x f
8. Note
I valori di conducibilita' vengono spesso espressi in mS x cm
elevato a -1. Secondo il nuovo sistema internazionale delle unita' di
misura (unita' SI) e' tuttavia necessario riportare tali risultati in
dS x m elevato a -1. Non e' necessario operare alcuna correzione, dal
momento che i valori risultano numericamente uguali (mS x cm elevato
a -1 = dS x m elevato a -1).
Il testo di questo provvedimento non riveste carattere di
ufficialità e non è sostitutivo in alcun modo della pubblicazione ufficiale
cartacea. La consultazione e' gratuita.
Fonte: Istituto poligrafico e Zecca dello Stato